紫外可见分光光度计的光学系统简介

紫外可见分光光度计的光学系统简介
    分光光度计的光学系统有许多类型，不同类型的光学系统，对测量方法和结果都有一定影响，下面，我们介绍几种常用分光光度计的光学系统。
（－）单光束光学系统：它是分光光度计中最简单的和应用最普遍的一种。它的特点是只有一条光束。通过交换参比和样品的位置，使其分别进入光路。在参比（溶剂）进入光路时，调零。然后将样品进入光路的信号和参比信号进行比较，就可在显示器上读出样品的透过率和吸光度。结构如图1所示。

 单光束分光光度计由于在每个波长都需要变换参比和样品的位置，所以只能手动，不能扫描吸收光谱。它的结构比较简单，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印装置，则对一些常规的定量测定（如医院化验室）还是比较适用的。
    国产754型、WFD－SA型、WFZ800D型分光光度计，以及国外的贝克曼DU型、岛津 QC－50、QR－50、日立 EPU－2A型、希尔格 H700型、C－4型等都属于这种类型的仪器。
（二）双光束光学系统：单光束分光光度计虽简单价廉，但有如下缺陷：即它要求在整个测定过程中光源必须稳定不变；另外光电转换器和放大器如有不规则的特性会给测量结果带来误差。为克服上述缺点，设计了双光束分光光度计。其结构示意图如图2所示。 

 双光束分光光度计的光路设计基本与单光束相似。差别在于双光束分光光度计的单色器的出射狭缝和样品室之间加了一个光束分裂器或斩波器，它的作用是以一定频率把一个光束交替分成两路。使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收（或两个匹配检测器分别接收）参比信号和样品信号。接收的光信号转变成电信号后，由前置放大器放大，最后由显示系统显示透光度或吸光度。为了保持参考光路在不同的波长有恒定光电流输出，常采用两种设计方法： 
一种是采用光电倍增管，电压恒定，但狭缝宽度随波长而变化；另一种是采用狭缝宽度恒定，但光电倍增管电压随波长而变化。后者便于在相同测定条件下对一些数据进行比较，双光束方式测定程序大大简化，不仅可直接读数、记录结果和数字显示，而且可进行“全波段自动扫描”，实现自动化分析，直接打印出分析结果，再加上附件的设置，更加扩展了它的使用范围。因此双光束分光光度计发展很快，使用更加普遍，比单光束分光光度计要优越得多。

（三）双波长／双光束分光光度计：由于单、双光束分光光度计都不能克服因非特征吸收信号（如试液混浊引起的散射，比色皿-空气界面与比色皿-溶液界面的折射差别等）的影响而带来测量中的误差。为此提出了双波长测定法，用双波长分光光度计来测定高浓度试样的混浊试样以及多组分混合物的定量分析具有很大的优越性，提高了灵敏度和准确度。

从图3可知双波长分光光度计的基本原理是：从同一个光源发出的光分成两束，分别经过两个单色器，得到两束具有不同波长（λ1和λ2）的单色光，利用切光器使这两束光以一定的时间间隔交替地照射到同一个试样池。经过光电倍增管和电子控制系统，在记录器上显示出两束光（λ1和λ2）的吸光度差⊿A，即⊿A=Aλ1－Aλ。只要λ1和λ2选择得适当（被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上则不吸收或很少吸收；而非检测物对两种波长的吸收是相同的），⊿A就为消除了非特征吸收影响（或称扣除了“背景吸收”）的吸光度。

如图4所示，设在双波长测定中，入射到试样池的两束光强度相同，对应波长分别为λ1和λ2，其中AS为背景吸收，则有Aλ1＝K1CL＋AS1  Aλ2＝K2CL＋AS2若λ1和λ2选择适当，则可认为 AS1= AS2= AS，即背景吸收相同，这样透过试样池的两束光的吸光度差值为?⊿A= Aλ1－Aλ2=（K1－K2·CL  ⊿A= Aλ1－Aλ2=（K1－K2·CL
从上式可看出：⊿A与被测组分的浓度C成正比。这就是双波长分光光度法定量分析的依据。 
下面以吸收点法测定二组分混合物中单个组分的含量为例，说明双波长分光测定的特点。如图4所示，图中A为干扰组分的吸收光谱；B为待测组分的吸收光谱；C为A和B的混合物的吸收光谱。选择A组分显示相等吸光度的两个波长λ1和λ2，则不管A组分浓度如何变化⊿A= Aλ1－Aλ2=0因此测定混合物C在λ1和λ2的吸光度差值，实际上就是B组分在λ1和λ2的吸光度差。由此可直接求得B组分的含量。
    这里必须指出：根据吸收曲线选择λ1和λ2时，应满足以下两个基本条件，即干扰组分在这两个波长应具有相同的吸光度，使干扰组分浓度的变化不影响测量值。其次，被测组分在这两个选定波长的吸光度差值应足够大，以便有足够的灵敏度。
 从上述分析可看出，双波长分光光度计有很多优点。首先它不用参比溶液，只用一个待测溶液，完全扣除了背景噪声的干扰，也大大提高了测定的准确度，可用于微量成分的测定；其次可用于相互有干扰的多组分混合物中，不经分离可直接进行各组分的分析。对于生物材料、医药、食品等试样的分析具有特殊重要意义。